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猪场病毒核酸提取常见问题解答

2022-03-31 2605人阅读 来源:
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样本前处理相关问题


1  对于环境样品含有太多杂质(泥沙、唾液样品里面含有饲料杂质)会对结果产生多大影响?是否可以在裂解之前对样品进行离心一次?这种离心操作会对检测结果产生影响吗?

对于杂质较多的样本,建议在提取前进行离心,取上清液进行提取,尽量不要取到其他杂质。如果含有过多杂质,对于磁珠法试剂盒,有可能会对核酸的纯度有影响,比如洗脱液有颜色的情况;对于柱式法试剂盒,有可能会出现纯化柱被堵塞的情况。
样品前处理环节进行离心,不会对检测结果产生影响。


2  针对很脏的环境拭子样品、精液样品和痰液样品有好的解决方案吗

样本前处理要按说明书规范进行,对于很脏的的环境拭子和精液样本,建议先离心,取上清液或精清样本进行提取;痰液样本,可直接取样进行提取,若太粘稠,建议用生理盐水或专用样本稀释液进行稀释后,再进行提取;
提取试剂盒的选择:建议选择裂解效果好、提取效率高的病毒核酸提取试剂盒。


3  纯化柱法提取核酸时,尤其是提取血液时,纯化柱可能会被红细胞堵塞,能否把原血液样品离心一次,用血浆来检测核酸吗

有数据显示,同一份血液样本,从全血样本提取的Ct值要比从血清提取的Ct值要小。所以还是更推荐从全血样本中进行提取、检测。
对提取血液样本会出现纯化柱堵塞的现象,如果没有取到血凝块的话,初步分析是所用试剂盒对血液的裂解效果偏弱的原因。建议可以换一款裂解效果更好的试剂盒进行提取,比较推荐明日达的病毒DNA提取试剂盒(V型)。这款试剂盒的裂解液和结合液均具有裂解作用,加之蛋白酶对蛋白的消化裂解的作用,可以很好地胜任各种血液样本的提取,甚至是有凝血现象的全血。


4  不同的样品,是否需要采用不同的核酸提取方法?如环境样品,血拭子等。

不同类型的样本按照各自的前处理方式完成样本前处理之后,可以采用同样的核酸提取方法进行提取。因为,一款合格的病毒核酸提取试剂盒应该满足各种不同样本类型的提取。

5  油性疫苗如果要检测非洲猪瘟病毒,有没有好的前处理方法?

对于疫苗样本,可以用生理盐水进行稀释,也可以用专门的裂解液进行稀释处理,然后再进行提取。
我们曾做过测试,用明日达的预分装提取试剂盒对油性疫苗直接进行提取,提取效果也是没有问题的。


6  样本前处理时的离心对转速和时间有没有要求?

建议严格按照说明书进行前处理。离心转速和时间如果偏低,有些杂质和残渣可能离心不彻底,对于磁珠法有可能会影响纯度,对于柱式法可能会造成柱膜堵塞。如果是转速较低的掌上离心机,可延长离心时间。


7  血清和环境离心多少转速好,转速高会不会对样品蛋白质有影响

离心转速建议按照说明书进行,一般为8000-12000g离心5min。转速过高一般不会对蛋白和病毒核酸有影响。


8  样品单检与混检有多大的区别

混检在日常病毒筛查检测中发挥着重要的作用。从技术可行性角度进行分析,通过对混样检测灵敏度的计算,采用5混1、10混1进行混检是切实可行的。新冠病毒的筛查检测也是采用5混1、10混1或者20混1的方式进行。
但采用混检时,需要注意以下几点:
(1)需提前预估待检测猪场的阳性率,根据不同的阳性率来选择不同数量的混检形式,以减少复检的次数;
(2)要保证所用核酸提取试剂的提取效率以及PCR检测试剂盒的检测灵敏度,以免造成假阴性;
(3)对混检可能造成的漏检风险进行评估,并制定相应的风险管控措施。

9  为什么会出现混合样品阳性,单测出现阴性

原因分析:1、混合样品为弱阳,可能在复检的过程中,样品出现降解,分开单个样品测试出现阴性;2、混合样品检测时,出现操作污染导致出现阳性。




试剂提取效率相关问题


10  磁珠法在特殊样本提取纯度较差,是不是可以理解特殊样本采用柱膜法更具优势呢?

这里提到的磁珠法提取特殊样本差,是从技术研发的角度出发,磁珠法提取在保证样本纯度方面相较于柱式法会面临更大的技术难题,如果磁珠选择不好或者磁珠与提取体系的搭配不好,就会出现各种问题,比如洗脱液粘稠、有颜色等。但是难度大不代表不可实现。通过数据对比展示明日达和T公司的磁珠法试剂盒,都在样本纯度和提取效率方面达到了比较高的标准。


11  柱式法病毒核酸提取可以做到不加蛋白酶K,那为什么还存在有蛋白酶K的版本?

我们的测试结果显示,对于普通的正常状态的样本,无蛋白酶K的试剂盒和有蛋白酶K的试剂盒提取效率是一致的。
但为了应对一些状态特别差的样本,比如凝血严重的血液、特别粘稠的样本,有蛋白酶K的试剂盒通过裂解液、结合液的双重裂解+蛋白酶K的消化,使其对于状态差样本仍然可以保证较高的提取效率。


12  您刚才展示了不同厂家产品提取效率比对数据,用的是你们自己的PCR扩增试剂做的结果么?对其他厂家的PCR试剂盒在搭配上是否有开放性?

对于提取试剂盒,除了搭配明日达PCR试剂盒,也搭配过另外三款有批准文号的PCR试剂盒,提取效率都是没有问题的。
至于我们公司的PCR试剂盒,很多实验室都是在用其他家的核酸提取试剂盒,匹配性也是没有问题的。也就是说,明日达的提取试剂盒和PCR试剂盒都是开放性的。


13  柱式提取和磁珠法提取相比核酸回收率怎么样?

各个生物试剂公司都有磁珠法试剂盒和柱式法试剂盒,但对各种样本类型的提取性能还是存在差异的。但不能因为某些个别情况(比如,A公司的磁珠法试剂盒比B公司的柱式法试剂盒提取效率低)就断定柱式法和磁珠法的核酸回收率,哪种方法更好一些。其实,从方法学上来看,柱式法和磁珠法都是比较成熟的方法。所以,比较优秀的柱式法试剂盒和磁珠法试剂盒的核酸回收率都会是比较高的。


14  不用裂解液的试剂会出现什么情况。

不用裂解液,直接从结合开始进行提取,提取效果肯定是不好的。
有的核酸提取试剂盒中没有裂解液这一个组分。其实这种试剂盒是需要搭配他们公司的病毒保存液进行使用的,这里的病毒保存液既有保存病毒的作用,又有裂解病毒的作用,所以用这种核酸提取试剂盒一定要搭配与其相匹配的病毒保存液。




PCR扩增相关问题


15  样品提取结束后,向离心管中转移提取后样品,样品中含有少量磁珠,对后续的检测是否有影响。

如果将磁珠加入到PCR扩增反应体系中,肯定会对PCR的检测产生影响,通常会出现扩增曲线异常,导致检测失败。
建议将核酸洗脱液进行瞬离,取上清进行PCR检测,切勿取到磁珠。


16  PCR样本初始背景荧光值就很高,样本也要离心很久,这该怎么解决呢?

背景荧光值高的原因:⑴、样本的本身含有荧光物质:样本的成分不同,血液,组织,环境,尤其是环境样本,成分更为复杂,且不同样本中不同成分的占比也不同,自然界几乎所有的物质都是可以“发光”的,只是发光的强弱不同,所以部分样本的某些组分或杂质有比较强的荧光物质,所以导致背景荧光值高;⑵、样本中含有能够被PCR仪激发后发光的物质:荧光PCR仪的检测原理是靠激发光激发检测试剂盒里的荧光探针发光从而测试靶标浓度的,基础荧光值高可能跟样本中含有某种物质,这种物质受到机器的激发波后,就会发出荧光,导致初始的背景荧光值升高。
那么知道背景荧光值高的原因后,我们可以对症治疗:⑴、选择高质量的核酸提取试剂产品:核酸提取能够去除绝大部分杂质,同时能够浓缩DNA,所以经过核酸提取后再进行检测是能够有效降低基质干扰的;⑵、核酸提取后仍然有荧光物质,最好就是进行小倍数的稀释,比如3倍或5倍稀释,这样就可以尽量不影响灵敏度的情况下,降低杂质或基质的干扰。

17  PCR扩增时,原始曲线正常,但是扩增曲线会显示异常,这是什么情况?

原始曲线正常,而扩增曲线异常,初步判断,可能是PCR仪器计算方式不同导致的,需要具体看PCR曲线再进行具体分析。

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