牛布鲁氏杆菌抗体检测试剂盒（间接法）

【试剂盒组分】

【试剂盒有效期】

2～8℃避光保存，有效期为12个月。

【需自备的材料】

微量移液器、量筒、酶标仪（450 nm）、去离子水、离心机（4000 rpm）、恒温培养箱（25℃）、计时器等。

【注意事项】

1.   试剂盒使用前各试剂应平衡至室温（至少40 min），使用后放回2~8℃保存。

2.   不同批号的试剂盒组份不得混用，不同试剂使用时应防止交叉污染。

3.   底物液不能暴露于强光或接触氧化剂。

4.   必须使用符合药典规定的水（如蒸馏水、去离子水或纯水）稀释洗涤液。

5.   待检血清数量较多时，应先稀释完所有待检血清，再加到酶标板上，使反应时间一致。

6.   终止液为强酸，若不慎溅到皮肤上请立即清洗。

7.   移液时，应尽量准确，防止产生气泡。

8.   应严格遵守各操作步骤规定的时间和温度。

【操作方法】

一、试剂配制

洗涤工作液：使用前，浓缩的洗涤液应恢复至室温（20～25℃），并摇动，使沉淀溶解（最好在37℃恒温培养箱中加热5～10 min），然后用蒸馏水作20倍稀释（例如：30 mL的浓缩洗涤液加上570 mL蒸馏水）混匀，稀释好的洗涤液2～8℃可存放7日。

二、样品处理

1.     取动物全血，待血液凝固后，4000 rpm离心10 min，收集上清。也可以自然凝固析出血清，无溶血。

2.     在血清稀释板中按1:50稀释阴、阳性对照品和待检血清样品（如245 ?L样本稀释液中加5 ?L待检血清样品），充分混匀。

三、操作步骤

1.     取包被板（根据样品多少，可拆开分次使用），将稀释好的待检血清取100 ?L加至抗原包被板中。同时设阴性对照2孔、阳性对照2孔，取稀释好的阴性、阳性对照各100 ?L分别加入反应孔中，轻轻振匀孔中样品，盖上盖板膜，室温下（25±2℃）温育30min。

2.     弃去孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液300 ?L，静置30 s后，弃去洗涤液。洗涤4次后在吸水纸上拍干（必须充分拍干）。

3.     配制酶结合物工作液：按体积比1:100（1份酶结合物浓缩液+99份酶结合物稀释液）混匀。

4.     每孔加酶结合物工作液100 ?L，盖上盖板膜，室温（25±2℃）下温育30 min。

5.     弃去孔中的溶液，洗涤4次，方法同2。

6.     将底物A液与底物B液按1:1混合均匀，加入孔中，100 ?L/孔，盖上盖板膜，室温下反应10 min。

7.     每孔加入终止液50 ?L，5 min内测定结果。

【结果判定】

在酶标仪上读各孔OD450nm值。

试验成立的条件是：

阴性对照平均OD450nm值＜0.20且阳性对照平均OD450nm值≥1.0，试验结果才有效；否则，应进行重复试验。

计算方法：

阴阳性判断：

S/P＜0.08时，判为阴性；S/P≥0.1时，判为阳性；0.08≤S/P＜0.1，判为可疑。

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