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ASFV核酸检测PCR异常曲线问题解析

2022-05-20 8058人阅读 来源:


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问题汇总


1  检测结果出现“翘尾”的原因是什么,该如何处理?

在PCR扩增过程中会出现两种翘尾情况,一种是阴性对照出现翘尾,基本可以判定为阳性质控或者阳性样本污染导致;另外一种是样品出现翘尾。如果样品呈现翘尾现象,则有可能是由于阳性污染、非特异性扩增和目的基因浓度低。其中,非特异性扩增出现的翘尾主要是因为某些试剂盒生产厂家使用的引物、探针不合理,生产工艺不达标,特点是样品出现大面积翘尾现象。
如果只是个别样品出现翘尾,可以按照以下步骤处理①、将原样本和重新采集猪场样品进行复检,复检仍然翘尾,判为低浓度病毒阳性。②、如果复检都为阴性,则有可能是实验室存在气溶胶污染,就要对实验室进行全面的通风、消毒处理,消杀后对环境、设备、耗材等进行PCR检测,检验消杀效果。


2  阳性对照或阳性样本不显示CT值及解决方案。

1)若阳性对照扩增曲线呈典型的“S”型曲线,但结果不显示CT值,出现这种情况的主要原因是仪器自动阈值线过高或过低。解决方案:通过手动调节阈值线解决此问题,阈值线一般设置在阳性对照扩增的起始,并高于阴性对照曲线。
2)若阳性对照没有扩增曲线,原因包括①、阳性对照未充分溶解或者阳性对照降解。解决方案:A、等阳性对照完全溶解后再进行实验。B、打开新的阳性对照进行实验,若新的阳性对照没有问题,表示旧的阳性对照降解。②、PCR反应液存在降解。解决方案:打开新的PCR反应液,使用同一阳性对照做交叉实验,若新的PCR反应液没有问题,表示旧的PCR反应液降解。


3  PCR管盖未盖严,导致里面的液体蒸发,是否会产生气溶胶,导致环境污染?

:阳性质控品和扩增后的阳性样本含有大量的目的基因片段,探针法荧光PCR的目的片段大小一般介于60-150bp之间,质量很小,容易随液体蒸发挥发到空气当中,形成气溶胶。积累到一定的程度,会对环境造成污染,在下次做PCR实验时,会出现假阳性结果。因此在实验之前一定要将管盖盖紧,同时对于新批次的PCR管,建议做气密性检测,防止气密性不严导致环境污染。


4  非洲猪瘟检测结果和临床诊断不符合,怎么解读?

非洲猪瘟检测结果和临床诊断不符合的原因主要有:
①、猪只处于感染初期的窗口期或者间歇性排毒期,在采样时未能采集到病毒。
②、采样是否具有代表性,若采集的样本没有代表性,会造成结果的假阴性,如对活猪尽量采集喉部拭子及抗凝血,病死猪采集脾脏和淋巴结,同时使用含内源基因的非洲猪瘟病毒试剂盒监测采样有效性。
③、送样过程中长时间未使用冷藏运输造成病毒降解,检测人员处理样本时未充分混匀等均可造成假阴性结果。

5  非洲猪瘟荧光PCR检测过程中,荧光抑制物有哪些?

:整个PCR反应过程中,主要涉及核酸提取和PCR扩增两个环节,采集的样本中含有许多成分会影响PCR反应进程,包括病毒的提取效率、聚合酶的活性和病毒的稳定性。主要的抑制物有内源性和外源性两种
①、内源性:天然纯正于标本中的标本组成成分,如免疫球蛋白、蛋白酶、血红蛋白、脂类、黏蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。
②、外源性:肝素抗凝剂、纤维素、硝酸纤维素,过度紫外照射的矿物油、手套滑石粉、标本容器或采样器材上的含有的抑制物。


6  放置PCR管时没有配平,是否会对仪器及结果产生影响?

①、配平的主要目的是让热盖压在pcr管压力、受热均匀,若经常不配平,会导致热盖倾斜,容易损坏仪器,建议按照仪器厂家要求进行操作。②、不配平短期内对结果无影响,若长期热盖倾斜,受热不均,有可能会导致结果异常。


7  检测结果经常出现CT值小于10的情况,该如何解读?

:首先先看扩增曲线是否正常,如果正常,代表病毒浓度较高。如果扩增曲线异常,需要分析具体是哪类异常曲线导致的,其中斜直线是最常见的曲线异常,出现这种情况可以通过调节基线和阈值线解决。


8  如果怀疑空气中有气溶胶污染,如何采集空气中的样本呢

:在未污染的实验室内取适量的PCR八联管,每个管内加入25微升PCR反应液,将PCR管打开盖子放置在怀疑有污染的实验室不同位置,半个小时后再盖上盖子进行扩增。若出现扩增曲线,则说明空气中存在气溶胶污染。

9  同一个样本,第一次检测为阳性,然后进行复检,结果为阴性,这种情况该如何解读

:此情况一般出现在弱阳性样本中。对于弱阳性样本,存在着泊松分布,每次吸到的病毒含量均不同,甚至没有吸到病毒,因此存在复测时平行结果不一致的情况。另外对于环境样本等弱阳性样本,放置时间长,核酸容易出现降解,也会出现复测时平行结果不一致的情况。出现此情况,建议重新采样进行检测,同时做三个平行,若有一个阳性,则判定为阳性。

10  实验结果阴性对照是阳性,一般是什么原因?

:阴性对照出现阳性,若曲线正常,则表示环境存在污染,需要对实验室进行清洁。若曲线是斜直线,考虑PCR反应液蒸发或者挂壁、PCR管不干净等因素。


11  实验上机结束后,八连管中有絮状物产生,是什么原因会出现这种情况?

:若血液样本使用免提取方法进行操作,因里面含有蛋白质、脂肪等杂质,会导致絮状物的产生。若经过核酸提取后还存在絮状物,表明核酸提取过程中杂质未去除干净。


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