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适用于猪场检测的病毒核酸提取试剂盒该如何选择?

2021-12-17 3345人阅读 来源:

近几年,随着非洲猪瘟病毒(African Swine fever virus,ASFV)和新型冠状病毒(SARS-CoV-2)在国内依次暴发,可以满足人们快速而精准检测需求的real-time PCR方法成为病原检测的主流。而核酸提取作为保障病毒核酸检测结果精准的重要环节也备受重视。2020年初,核酸提取市场需求火热,市面上甚至出现了核酸提取仪一机难求的局面。巨量的核酸提取市场需求极大刺激各大IVD研发企业争相推出相关产品。仅仅一年的时间,在2021年的杭州兽医检测诊断大会上出现了家家展位有核酸提取的盛况。如何在这些眼花缭乱的产品中,选出适合我们自身需求的那一款对我们来说也是一种极大的考验。

一、提取试剂盒的类型

虽然市面上病毒核酸提取试剂盒的产品非常多,但按照提取类型和提取方式不同大概可以分为以下几类:

1. 提取类型

主要可以分为DNA提取、RNA提取和DNA/RNA共提取。DNA提取和RNA提取的主要区别在于:DNA易溶于高盐、高pH,而RNA易溶于低盐、低pH,且RNA提取还需要抑制RNase的活性。DNA/RNA共提取则需要调整一个既适合于DNA也适合于RNA的盐浓度和pH,且抑制RNase的活性,如何将两个需求矛盾的产品良好的融合在一起,也对各企业提出了更高的技术要求。


2提取方式

从提取方式划分,主要可分为机提和手提。目前市面上的机提主要是磁珠法的自动化提取,其具有自动化程度高、操作简便、提取通量高等特点。手提可分为磁珠法手提和柱式法手提,适用于样本量较少的情况。汇总比较如表1所示。


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二、提取试剂盒该如何选择?

在牧场条件下,病原种类较多,需检测的样本类型也是复杂多样,对核酸提取试剂的适应性就有了更高的要求。我们可以结合日常检测的需求,选择一款满足自身牧场需要的产品类型。


(1) 同时满足DNA/RNA提取

猪病毒类型多样,如果选择DNA或RNA单提取试剂盒,需要采购两种不同的试剂盒,采购需求就会比较混乱,而且稍不注意就会混用,导致检测提取的失败,这种情况也是经常发生,所以一款能同时满足DNA/RNA共提取的产品就可以避免出现这种情况。


(2) 操作简便快捷、高通量

全自动磁珠法核酸提取在几种提取方式中是最为简单的,可以减少人工操作,减少人为误差,并且可以高通量提取,适应于中大型猪企每天做大量样本检测,但是全自动提取设备的价格较贵。对于每天只有少量样本检测需求的企业来说,磁珠手提法可以作为一个优选,它相对柱式手提法操作更为简便,对设备要求相对更低。


(3) 提取时间短

有些时候,猪场对于检测结果需求较为迫切,那么提取时间也是越短越好,以前提取产品时间大多数在半个小时以上,目前大部分机提法产品可以实现提取时间≤15min,这类产品提取时间短,同时也能保证提取效率。手提磁珠法相对柱式法,减少操作步骤,简化操作方式,提取时间更短。


(4) 提取效率是根本

对于不同的病毒类型(DNA或者RNA病毒)、不同的病毒浓度(强阳、中阳、弱阳)、不同的样本类型(血液、组织、环境、饲料等),都应保证提取试剂盒具有较高的提取效率,这也是确保检测结果准确性的重要保障。


(5) 样本适应性强

不同的病原体具有不同的组织嗜性,且排毒方式和载量也各不相同,在疫病诊断过程中,样本类型的差别较大,并且在生物安全防控过程中检测的样本范围也不再仅仅局限于宿主本身,这就导致了在猪场疫病检测和监测过程中,遇到的样本类型会更加复杂。对于磁珠法病毒DNA/RNA提取试剂盒而言,裂解液的优化、磁珠的选择以及两者之间的搭配,是决定其是否具有良好的样本适用性的关键因素。


三、日常遇到的小问题

由于核酸提取技术得到广泛的应用,在日常检测中也遇到了很多有趣的问题,今天小编也选取了几个常见的问题,跟大家简单聊一聊。


问题一、当前用量最大的新冠专用提取试剂盒和非瘟用提取试剂盒有什么区别?

(1) 提取病毒类型和大小的不同。SARS-CoV-2属于RNA病毒,基因组大小约为30kb;ASFV属于DNA病毒,基因组大小为170~193kb;两者提取的技术难度有很大区别。

(2) 样本类型的差异。SARS-CoV-2的样本主要是咽拭子、鼻拭子和环境样本,样本类型相对单一;ASFV的样本包括全血、血清、血浆、唾液、精液、鼻咽拭子、环境、组织、粪便、饲料等,样本类型纷繁复杂。

当前牧场用提取试剂盒虽然有广泛的适应性,但难免也会碰到很多问题,小编将ASFV提取中经常遇到的样本适用性差的现象和原因总结如下,可供大家参考:


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问题二、不加蛋白酶K,会影响病毒DNA/RNA的提取效率吗?

在核酸提取中,蛋白酶K的主要作用是:消化蛋白,尤其是消化核酸-蛋白复合体中的蛋白,从而使核酸释放。真核生物细胞核中的核酸大部分是以染色体的形式存在,在提取真核生物DNA时,如果不加蛋白酶K,提取总量会大大降低。而病毒的结构相对比较简单,主要由蛋白外壳和拟核组成,无染色体结构,且核酸含量相对较少。所以,对于病毒DNA/RNA,通过优化提取试剂盒的裂解细胞、变性蛋白以及去除杂质的能力,完全可以做到不使用蛋白酶K,也能保证较高的提取效率。


问题三、样本量越多,提取得到的核酸岂不是越多?

样本量增加,如果相应的裂解液、结合液以及吸附核酸的介质液相应增加,提取到的核酸也会相应增多。但对于磁珠法预分装试剂而言,增加样本量,相应的裂解结合液、磁珠没有增加,即相应的裂解、结合能力没有提高,提取到的核酸有可能不会增加反而减少,而且增加样本量会使2.2mL深孔板内总体积增加,提取时存在溶液溢出造成混样的风险。对于柱式法而言,如果只是增加样本量,提取效果也可能会适得其反。


问题四、核酸提取效率如何评价?

(1) 用标准物质来测定核酸提取试剂盒的提取灵敏度;

(2) 与市面上认可度较高的提取试剂盒对比提取真实的病毒样本,分别提取不同样本类型的强阳、中阳、弱阳样本,比较两者的Ct值。


我们通过测评市面上很多提取产品过程中发现,核酸提取试剂盒的质量差异较大,差异不单单是体现在提取的效率,还有样本的适应性上面。这就要求我们自身要提高检验产品质量的能力,从而选出一款真正适应牧场检测需求的产品。


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